本研究旨在通过博清生物科技（南京）有限公司研发生产的荧光定量PCR仪技术，深入探究某基因在植物响应干旱、高温等逆境胁迫下的表达模式。以拟南芥为实验材料，分别对其进行干旱和高温处理，提取不同处理时间点的总RNA，反转录为cDNA 后，运用荧光定量PCR仪检测目标基因的表达量变化。结果显示，该基因在干旱和高温胁迫下的表达呈现出动态变化趋势，在不同处理时间点具有显著差异，表明该基因可能在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本研究为进一步解析植物抗逆分子机制提供了理论依据，也为后续培育抗逆植物新品种奠定了基础。

一、引言

植物在生长发育过程中，不可避免地会遭遇各种逆境胁迫，如干旱、高温、低温、盐渍等。这些逆境胁迫严重影响植物的生长、发育和产量，甚至导致植物死亡。为了应对逆境胁迫，植物在长期的进化过程中形成了一系列复杂而精细的生理和分子调控机制 。基因表达调控是植物响应逆境胁迫的重要方式之一，通过调控相关基因的表达，植物可以合成特定的蛋白质或代谢产物，从而增强自身的抗逆能力。

博清生物科技（南京）有限公司研发生产的荧光定量PCR仪是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。它具有灵敏度高、特异性强、重复性好、能准确定量等优点，已成为研究基因表达调控的重要技术手段。利用荧光定量PCR仪技术，科研人员可以快速、准确地检测目标基因在不同组织、不同发育阶段以及不同环境条件下的表达水平，从而深入了解基因的功能和表达调控机制。

目前，已有大量研究利用荧光定量PCR仪技术对植物响应逆境胁迫的基因表达模式进行了分析，并鉴定出了许多与植物抗逆相关的基因 。然而，对于某基因在植物响应逆境胁迫中的作用机制仍有待进一步深入研究。因此，本研究以拟南芥为材料，运用荧光定量PCR技术分析某基因在干旱和高温胁迫下的表达模式，以期为揭示该基因在植物抗逆过程中的功能提供理论依据。

二、材料与方法

（一）实验材料

选用野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0生态型种子，将种子用70%乙醇消毒30s，再用0.1%升汞消毒5min，无菌水冲洗5-6次后，播种于含有1/2MS培养基（含0.8% 琼脂，3%蔗糖，pH5.8）的培养皿中。将培养皿置于4℃冰箱春化2-3d后，转移至人工气候箱中培养，培养条件为：光照强度 150μmol・m⁻²・s⁻¹，光周期16h光照/8h黑暗，温度22±1℃，相对湿度60-70%。待拟南芥幼苗长至4-5周龄时，用于后续胁迫处理实验。

（二） 胁迫处理

1、干旱胁迫处理：选取生长状态一致的4-5周龄拟南芥植株，停止浇水，进行干旱胁迫处理。分别在胁迫0h（对照组）、6h、12h、24h、48h 和 72h 时，采集植株地上部分组织，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存备用。

2、高温胁迫处理：将生长状态一致的4-5周龄拟南芥植株置于42℃的人工气候箱中进行高温胁迫处理。同样在胁迫0h（对照组）、1h、2h、4h、6h和8h时，采集植株地上部分组织，液氮速冻后于-80℃冰箱保存。

（三）总RNA提取与cDNA合成

采用TRIzol试剂（Invitrogen，美国）提取各处理时间点拟南芥植株地上部分组织的总RNA。具体操作按照TRIzol试剂说明书进行。提取的总RNA经1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用分光光度计测定其浓度和纯度，确保OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.8-2.0之间。

取1μg总RNA，利用反转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa，日本）将其反转录为cDNA。反应体系和反应条件按照试剂盒说明书进行操作，合成的cDNA于-20℃冰箱保存备用。

（四）荧光定量 PCR 分析

以合成的cDNA为模板，利用SYBR Green 荧光染料法进行荧光定量PCR分析。目标基因的引物根据拟南芥基因组数据库中该基因的序列信息，利用Primer Premier 5.0软件设计合成，引物序列见表1。同时，选择拟南芥的Actin2基因作为内参基因，用于对目标基因的表达量进行归一化处理。

荧光定量PCR反应在LightCycler 480 II实时荧光定量PCR仪上进行。反应体系为20μL，包括10μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，0.8μL 上游引物（10μmol/L），0.8μL 下游引物（10μmol/L），1μL cDNA 模板，7.4μL ddH₂O。反应条件为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环；最后进行熔解曲线分析，以验证PCR产物的特异性。每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复。

（五）数据分析

采用2⁻ΔΔCt法对荧光定量PCR数据进行分析，计算目标基因在不同处理时间点相对于对照组的相对表达量。其中，ΔCt=Ct（目标基因）-Ct（内参基因），ΔΔCt=ΔCt（处理组）-ΔCt（对照组）。利用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行统计分析和绘图，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和 Dunnetts 多重比较检验分析不同处理时间点目标基因表达量的差异显著性，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

三、结果与分析

（一）总RNA提取与cDNA合成质量检测

1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，提取的总RNA呈现出清晰的28S、18S和5S rRNA条带，且28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍，表明提取的总RNA完整性良好，无明显降解。分光光度计检测结果显示，各样本总RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值均在1.8-2.0之间，说明总RNA纯度较高，可用于后续的反转录实验。反转录合成的cDNA经稀释后，作为荧光定量PCR的模板，能够有效扩增出目标基因和内参基因，表明cDNA合成质量良好。

（二）荧光定量PCR扩增产物特异性分析

熔解曲线分析结果显示，目标基因和内参基因的PCR扩增产物均呈现出单一的峰，表明PCR扩增产物具有良好的特异性，无非特异性扩增和引物二聚体产生。这为后续准确分析目标基因的表达量提供了可靠保障。

（三）某基因在干旱胁迫下的表达模式

荧光定量PCR仪结果显示，在干旱胁迫下，某基因的表达量随胁迫时间的延长呈现出先升高后降低的变化趋势。在干旱胁迫6h 时，该基因的表达量开始显著升高，为对照组的2.3 倍（P<0.05）；在胁迫12h时，表达量达到峰值，约为对照组的4.1倍（P<0.01）；随后，表达量逐渐下降，在胁迫72h时，表达量仍显著高于对照组（P<0.05）。这表明该基因可能在植物响应干旱胁迫的早期阶段发挥重要作用，参与植物的干旱胁迫应答过程。

（四）某基因在高温胁迫下的表达模式

在高温胁迫处理过程中，某基因的表达量也发生了明显变化。高温胁迫1h时，该基因的表达量即显著升高，为对照组的1.8倍（P<0.05）；在胁迫2h时，表达量进一步增加，达到峰值，约为对照组的3.2倍（P<0.01）；之后，表达量逐渐降低，在胁迫8h时，表达量仍高于对照组，但差异不显著（P>0.05）。这些结果表明该基因对高温胁迫也具有快速响应能力，可能在植物抵御高温伤害的过程中发挥一定的作用。

四、讨论

本研究利用博清生物科技（南京）有限公司研发生产的荧光定量PCR仪技术，系统分析了某基因在植物响应干旱和高温胁迫过程中的表达模式。结果表明，该基因在干旱和高温胁迫下的表达均发生了显著变化，且表达模式具有一定的相似性，即在胁迫初期表达量迅速升高，随后逐渐降低。这一结果与以往一些研究中发现的植物抗逆相关基因的表达模式一致 ，说明该基因可能参与了植物对逆境胁迫的应答过程。

在干旱胁迫下，植物会感知到水分亏缺信号，并通过一系列信号转导途径激活相关抗逆基因的表达，以调节植物的生理和代谢过程，增强植物的抗旱能力。本研究中某基因在干旱胁迫早期迅速上调表达，推测其可能在植物感知干旱信号、启动抗旱应答反应的过程中发挥作用。该基因可能编码与渗透调节、活性氧清除、细胞膜稳定性维持等相关的蛋白质，从而帮助植物适应干旱环境 。例如，其编码的蛋白可能参与调控脯氨酸、甜菜碱等渗透调节物质的合成，或者参与抗氧化酶系统的调节，清除干旱胁迫下产生的过量活性氧，减轻氧化损伤。

在高温胁迫下，植物细胞内的蛋白质、核酸等生物大分子会受到损伤，细胞膜的结构和功能也会遭到破坏。植物通过诱导一系列热激蛋白（HSPs）和其他抗逆相关基因的表达，来维持细胞的正常生理功能，提高自身的耐热性。本研究中某基因在高温胁迫初期的快速表达，提示其可能与植物的高温胁迫响应机制密切相关。它可能编码的蛋白有助于稳定细胞内的蛋白质构象，防止蛋白质变性和聚集，或者参与修复高温胁迫造成的细胞损伤。然而，具体的作用机制还需要进一步通过基因功能验证实验，如基因过表达、基因敲除等方法进行深入研究。

此外，本研究仅分析了某基因在干旱和高温两种逆境胁迫下的表达模式，而植物在自然环境中往往同时面临多种逆境胁迫的复合作用。未来的研究可以进一步探讨该基因在多种逆境胁迫复合条件下的表达调控机制，以及与其他抗逆相关基因之间的相互作用关系，从而更全面地揭示植物响应逆境胁迫的分子机制。同时，可以结合蛋白质组学、代谢组学等技术，从多个层面深入研究该基因在植物抗逆过程中的功能。

五、结论

本研究通过博清生物科技（南京）有限公司研发生产的荧光定量PCR仪技术，成功分析了某基因在拟南芥响应干旱和高温胁迫过程中的表达模式。结果表明，该基因在干旱和高温胁迫下均呈现出动态表达变化，且在胁迫初期表达量显著上调，提示其可能在植物响应逆境胁迫过程中发挥重要作用。本研究为进一步深入研究该基因的功能和植物抗逆分子机制提供了理论依据，也为后续利用基因工程技术培育抗逆植物新品种奠定了基础。但该基因在植物抗逆过程中的具体作用机制仍需进一步深入研究。